先判断该不该做，再选路线，然后才是实验。选路线看两处：样本来源、数据判定口径，通量排在其后。
扰动测序（perturbation sequencing，含 Perturb-seq、CROP-seq 等）是在单细胞分辨率上测量基因干预后的表达响应，是虚拟细胞模型的核心训练数据来源。实施路径为五步：判断必要性 → 选路线 → 备前置条件 → 执行与质控 → 分析与资产化。最容易出问题的是两个环节：一是样本与对照组设计不足，导致效应量被批次淹没；二是缺少分析承接方，数据产出后无法解释。君录生物医药承接从方案设计到可训练数据集的全链路，并在项目开始时先判断"该不该做"。
扰动测序的成本与周期都不低。以下五种情况，用更省的方式能得到同样结论。
六条常见路线，按样本类型与要回答的问题来选。
| 路线 | 读出 | 通量 | 最适合 | 主要限制 |
|---|---|---|---|---|
| Perturb-seq pooled CRISPR + scRNA | 单细胞转录组 + sgRNA 身份 | 中—高（数十至数百靶点/批） | 细胞系或易编辑原代细胞上的靶点筛选 | 需要较高编辑效率；原代细胞上效率折损明显 |
| CROP-seq | 单细胞转录组 + sgRNA 转录本 | 中 | 需要保留 sgRNA 与表达一一对应的场景 | 载体构建与滴度要求较高 |
| Perturb-multiome | 转录组 + 染色质可及性 | 中—低 | 需要区分"直接调控"与"下游连带" | 单细胞回收率低，成本高 |
| 化学扰动 小分子处理 + scRNA | 单细胞转录组 | 高 | 药物浓度/时程响应、老药新用 | 无法定位到具体靶点，是表型层证据 |
| 体内扰动 AAV/其他递送 + scRNA | 单细胞转录组（含微环境） | 低 | 需要保留组织架构与细胞互作的问题 | 周期长、动物伦理与递送效率限制、样本量小 |
| 细胞系高通量路线 商品化服务 · 万—百万级 | 单细胞转录组 + sgRNA 身份 | 高（万—百万细胞/批） | 大规模靶点初筛、方法学参数比对 | 限细胞系背景，无组织微环境与个体差异 |
以下八项在实验启动前应逐一确认；缺一项，后期的返工成本往往高于重做。
| 交付件 | 内容 | 用途 |
|---|---|---|
| 实验设计书 | 扰动策略、靶点清单、对照结构、样本量测算依据 | 伦理申报与项目立项 |
| 原始数据与质控 | 测序数据、编辑效率报告、细胞级 QC 指标 | 可复核的原始层 |
| 扰动效应矩阵 | 每个扰动 × 每个基因的效应量与显著性（含供体层面） | 筛选与排序 |
| 可重复性报告 | 供体间、批次间一致性检验 | 判断结论能否外推 |
| 可训练数据集 | 标准化格式 + 字段说明 + 划分建议 | 喂给虚拟细胞模型 |
| 基线对拍报告 | 与线性/加性基线的同台比较 | 判断模型是否真有增量 |
| 方法学参数记录 | 实验参数、试剂与仪器、软件版本与阈值、质控判定方法 | 供作者撰写 Methods 时引用 |
标准周期、样本量与费用按项目形态评估。把疾病方向、样本来源与可供样本量告诉我们，首轮沟通即可给出路线建议与周期预估。
交付件齐不齐是一件事，数据能不能用是另一件事。我们按下面三层判据验收，任一层不达标即不进下一层。
| 层 | 验收判据 | 不达标的处置 |
|---|---|---|
| L1 入库 能不能读、能不能关联 |
原始计数为非负整数；矩阵与字段说明齐全；基因主键统一；元数据字典；样本—文库—批次—细胞四级可回溯；参考基因组与注释版本写死；文件校验值；批次字段进元数据 | 退回补交，不计入交付 |
| L2 可训练 能不能进模型 |
每个扰动的可用细胞数按档声明；测序深度分布；编辑效率必报且报分布；低于阈值的扰动剔除并留痕；对照为同批次；sgRNA 分配置信度；双细胞识别；细胞级 QC；扰动级协变量（剂量、时间点、重复）；重复结构；效应量 | 不得宣称可用于模型训练 |
| L3 可引用 别人能不能复核、能不能引 |
重复相关性；细胞与组织的本体标识；持久标识（DOI）；可复现包（代码、容器、参数、随机种子）；细胞系身份核验（STR、支原体、代次）；版本记录 | 仅作内部数据使用，不进对外数据集 |
判据项公开，具体阈值随项目类型约定。心肌与肝组织的线粒体本底明显高于外周血，一刀切的阈值会误杀正常细胞。三道硬门槛：细胞数达档、效率达阈且已剔除、对照同批次——任一不过，整批不进可训练档。
原代细胞的编辑效率常显著低于细胞系。若不单独报告效率，"未检出变化"就无法区分"这个基因不重要"与"根本没敲掉"。效率必须作为显式变量进入模型，按实测值入模。
原代细胞的批次变异往往大于扰动效应。用另一批样本作对照，得到的差异里混着批次、供体、培养时间三重混淆。正确做法是同一供体、同一批次的未扰动对照。
数千个细胞不等于数千个独立样本。供体才是统计单位，否则显著性来自技术重复。这也是大量扰动研究在外部数据上复现失败的主要原因之一。
分析方介入越晚，可补救的余地越小——尤其是对照结构与效率记录，属于"事后无法补做"的部分。建议在实验设计阶段就确定分析方。
取决于路线。靶向数十个基因的 Perturb-seq，通常每个扰动需要数百到数千个被成功编辑的细胞才能稳定估计效应，考虑编辑效率折损后上样量需按效率反推；全基因组筛选则需千万级细胞。原代细胞场景下，样本量往往由可供组织量决定。
实验部分可在医院或合作平台完成。数据分析与资产化是独立环节，包含编辑效率校正、批次建模、供体间可重复性检验与基线对拍，通常需要外部承接；分析方宜在实验开始前确定。
三条路径：一是更换递送方式（病毒、电转、LNP 等按细胞类型择优）；二是改用不依赖切割的干扰方式（CRISPRi 抑制而非敲除）；三是把编辑效率作为显式变量纳入模型。第三条决定数据能不能用。
不能。扰动测序给出的是候选与效应方向，属于假说层。要成为靶点判断，还需独立数据集复现、人类遗传学证据（如 eQTL、孟德尔随机化）与湿实验验证。它适合当筛选证据用。
细胞系路线通常以周计；临床原代与体内路线以季度计，周期主要由样本积累、伦理流程与递送方案优化决定。给出样本来源与可供量后，可在首轮沟通给出具体周期与样本量测算。